1、环境要清洁，进行无菌操作前半小时，须停止清扫地面等工作。避免不必要的人群流动，防止尘埃飞扬。治疗室应每天用紫外线消毒一次。
2、进行无菌操作时，衣帽穿戴要整洁。帽子要把全部头发遮盖，口罩须遮住口鼻，并修剪指甲、洗手。
3、无菌物品与非无菌物品应分别放置。无菌物品不可暴露在空气中，必须放于无菌包或无菌容器内，无菌物品一经使用后，必须再经灭菌处理后方可使用。从无菌容器中取出的无菌物品，虽未使用，也不可放回无菌容器内。
4、无菌包应注明物品的名称、消毒灭菌日期，并按日期先后顺序排放，以便取用，放在固定的地方。无菌包在未污染的情况下，可保存7-14天，过期应重新灭菌。 5、取无菌物品时，必须用无菌持物钳（镊）。未经消毒的用物不可触及无菌物或跨越无菌区。
6、进行无菌操作时，如器械、用物疑有污染或已被污染，即不可使用，应更换或重新灭菌。
7、一份无菌物品，只能供一个病员使用，以免发生交叉感染。 无菌操作注意事项：
1. 实验进行前，无菌室及
无菌操作台(laminar flow) 以紫外灯照射30-60 分钟灭菌，以70 % ethanol 擦拭无菌操作抬面，并开启
无菌操作台风扇运转10 分钟后，才开始实验操作。每 次操作只处理一株细胞株，且即使培养基相同亦不共享培养基，以避免失误混淆或细胞间 污染。实验完毕后，将实验物品带出工作台，以70 % ethanol 擦拭无菌操作抬面。操作间 隔应让
无菌操作台运转10 分钟以上后，再进行下一个细胞株之操作。
2. 无菌操作工作区域应保持清洁及宽敞，必要物品，例如试管架、吸管吸取器或吸管盒等可
以暂时放置，其它实验用品用完即应移出，以利于气流之流通。实验用品以70 % ethanol 擦 拭后才带入无菌操作台内。实验操作应在抬面之中央无菌区域，勿在边缘之非无菌区域操 作。
3. 小心取用无菌之实验物品，避免造成污染。勿碰触吸管尖头部或是容器瓶口，亦不要在打
开之容器正上方操作实验。容器打开后，以手夹住瓶盖并握住瓶身，倾斜约45° 角取用， 尽量勿将瓶盖盖口朝上放置桌面。
4. 工作人员应注意自身之安全，须穿戴实验衣及手套后才进行实验。对于来自人类或是病
毒
感染之细胞株应特别小心操作，并选择适当等级之无菌操作台(**少Class II)。操作过程 中，应避免引起aerosol 之产生，小心毒性药品，例如DMSO 及TPA 等，并避免尖锐针头之伤害等。 5. 定期检测下列项目： 5.1. CO2 钢瓶之CO2 压力
5.2. CO2 培养箱之CO2 浓度、温度、及水盘是否有污染(水盘的水用无菌水，每周更换)。 5.3. 无菌操作台内之airflow 压力，定期更换紫外线灯管及HEPA 过滤膜，预滤网(300 小时/预滤网，3000 小时/HEPA)。
6. 水槽可添加消毒剂(Zephrin 1:750)，定期更换水槽的水 植物外植体消毒和接种：
用于进行组织培养的组织、器官和细胞称为外植体。在组织培养中，外植体如果是带菌的，在接种前都必须进行表面消毒，这是取得培养成功的**基本的和重要的前提。常用消毒剂对外植体进行消毒。从室外取的材料，一般先用自来水冲洗数分钟，对表面不光滑或长有绒毛等结构不容易洗净的材料，自来水冲洗的时间要长，几个小时或过夜，并且用洗衣粉或洗洁精洗涤，必要时用毛刷刷洗。洗后的材料用滤纸擦干，然后浸泡在消毒溶液中。接种材料使用消毒剂后，要用无菌水洗涤3～5 遍，**后用无菌纸擦干净。使用消毒剂的原则是既要达到消毒目的，又不能损伤植物组织和细胞，还要符合就地取材的原则。对一些容易污染、较难灭菌的外植体进行表面消毒时，用单一消毒剂不能收到好的效果，所以常选用两种消毒剂交替浸泡法。一般，shou先用75％乙醇浸泡外植体数秒钟**30s，然后置于0.1％氯化汞溶液5～10min 或含有2％活性氧的次氯酸钠溶液5～30min，然后用无菌水洗涤。有时在氯化汞或次氯酸钠灭菌后，用无菌水洗，进一步剥去几层组织或器官如叶片后，再用次氯酸钠灭菌3～5min，无菌水漂洗3 次后，切割、用于接种。
用消毒剂对接种材料进行灭菌处理时，可以在灭菌溶液中加入1～2 滴表面活性剂，如吐温80或吐温20，它们可以湿润外植体整个组织，促进灭菌液充分接触表面组织，达到较好的消毒效果。有时还可以用磁力搅拌、超声振动等方法使消毒杀菌剂进入外植体。消毒溶液对外植体消毒是在
超净工作台上进行。完成表面消毒的接种材料要尽快放置于培养基中。
植物外植体消毒和接种(以胡萝卜为例)：
1 ．接种前，用75 ％乙醇棉球或用2％苯扎溴铵溶液擦拭
超净工作台台面，将培养基及用具放入工作台，开
超净工作台紫外灯照射**少20 min，然后开送风开关，之后关闭紫外灯，通风10 min后，再开日光灯进行无菌操作。
2 ．将胡萝卜块根在自来水下冲洗干净，用小刀切去外围组织，切成小块分别放100 mL 烧杯中，用75％乙醇溶液浸泡30s，然后用0.1%氯化汞溶液分别浸泡2 、5 、10 min ，用无菌水洗涤3 次，无菌纸吸干水分。取出培养皿，剪刀和镊子使用前插入90％乙醇溶液中，使用镊子时在酒精灯火焰上炽烧片刻，冷却后，切取髓部组织0.5cm 。以上操作都要在试管口靠近火焰旁。#p#分页标题#e#3 ．将培养容器斜面向上，并使它们拉于水平位置，也可将培养容器放在左手中。将塞盖用右手拧转松动，以便接种时拔出。用火焰灼烧管口，灼烧时应不断转动试管口（靠手腕的动作，使试管口沾染的少量菌得以烧死）。将烧过的接种针（环）触动培养基部分，使其冷却，以免烧死被接种的外植体，然后轻轻接触外植体，慢慢将接种针（环）抽出试管，打开培养容器盖，将外植体放在培养基上，每瓶放3 块。封口，贴标签，注明姓名，标明时间和材料名称。整理好接种室（箱）的台面，搞好清洁卫生。
4 ．用水洗干净非洲澎蜞菊叶片，用滤纸擦干后置于100 mL 烧杯中，在超净工作台上加入75％乙醇溶液浸泡30s，然后用0.1％氯化汞溶液浸泡3 、5 、7 min，用无菌水洗涤3 次，将叶片切成长1cm ,按照上述同样的步骤接种于培养基上。
5 ．绿豆种子用75％乙醇溶液浸泡30 s，然后用0.1％氯化汞溶液（加入吐温2 滴）浸泡3 、5 、10 min ，期间不断搅拌溶液，用无菌水洗涤5～6 遍，洗干种子外围水分，按照上述同样的步骤接种于培养基上。
无菌操作原则：
一、在执行无菌操作时，必须明确物品的无菌区和非无菌区。
二、执行无菌操作前，先戴帽子、口罩、洗手，并将手擦干，注意空气和环境清洁。 三、夹取无菌物品，必须使用无菌持物钳。 [无菌操作间]
无菌操作间
四、进行无菌操作时，凡未经消毒的手、臂、均不可直接接触无菌物品或超过无菌区取物。 五、无菌物品必须保存在无菌包或灭菌容器内，不可暴露在空气中过久。无菌物与非无菌物应分别放置。无菌包一经打开即不能视为**无菌，应尽早使用。凡已取出的无菌物品虽未使用也不可再放回无菌容器内。
六、无菌包应按消毒日期顺序放置在固定的柜橱内，并保持清洁干燥，与非灭菌包分开放置，并经常检查无菌包或容器是否过期，其中用物是否适量。
七、无菌盐水及酒精、新洁尔灭棉球罐每周消毒一次，容器内敷料如干棉球、纱布块等，不可装得过满，以免取用时碰在容器外面被污染。
原则及注意事项
无菌操作原则：
一、在执行无菌操作时，必须明确物品的无菌区和非无菌区。 二、执行无菌操作前，先戴帽子、口罩、洗手，并将手擦干，注意空气和环境清洁。 三、夹取无菌物品必须使用无菌持物钳。
无菌操作间
四、进行无菌操作时，凡未经消毒的手、臂、均不可直接接触无菌物品或超过无菌区取物。 五、无菌物品必须保存在无菌包或灭菌容器内，不可暴露在空气中过久。无菌物与非无菌物应分别放置。无菌包一经打开即不能视为**无菌，应尽早使用。凡已取出的无菌物品虽未使用也不可再放回无菌容器内。 六、无菌包应按消毒日期顺序放置在固定的柜橱内，并保持清洁干燥，与非灭菌包分开放置，并经常检查无菌包或容器是否过期，其中用物是否适量。 七、无菌盐水及酒精、新洁尔灭棉球罐每周消毒一次，容器内敷料如干棉球、纱布块等，不可装得过满，以免取用时碰在容器外面被污染。
无菌操作技术及注意事项
1、玻璃器皿的消毒和清洁 ⑴新购玻璃器皿的处理新购玻璃器皿应用热肥皂水洗刷，流水冲洗，再用1%～2%盐酸溶液浸泡，以除去游离碱，再用水冲洗。对容量较大的器皿如试剂瓶、烧瓶或量具等，经清水洗净后应注入浓盐酸少许，慢慢转动，使盐酸布满容器内壁数分钟后倾出盐酸，再用水冲洗。 ⑵污染玻璃器皿的处理 ①一般试管或容器可用3%煤酚皂溶液或5%石炭酸浸泡，再煮沸30分钟，或在3%～5%漂白粉澄清液内4小时，有的亦可用肥皂或合成洗涤剂洗刷使尽量产生泡沫，然后用清水冲洗**无肥皂为止。**后用少量蒸馏水冲洗。 ②细菌培养用的试管和培养皿可先行集中，用1kg/cm2高压灭菌15～30分钟，再用热水洗涤后，用肥皂洗刷，流水冲洗。 ③吸管使用后应集中于3%煤酚皂溶液中浸泡24小时，逐支用流水反复冲洗，再用蒸馏水冲洗。 ④油蜡沾污的器皿，应单独灭菌洗涤，先将沾有油污的物质弃去，倒置于吸水纸上，100℃烘干半小时，再用碱水煮沸，肥皂洗涤，流水冲洗。必要时可用二甲苯或汽油去油污。 ⑤染料沾污的器皿，可先用水冲洗，后用清洁或稀盐酸洗脱染料，再用清水冲洗。一般染色剂呈碱性，所以不宜用肥皂的碱水洗涤。 ⑥玻片可置于3%煤酚皂溶液中浸泡，取出后流水冲洗，再用肥皂或弱碱性煮沸，自然冷却后，流水冲洗。被结核杆菌污染或不易洗净的玻片，可置于清洁液内浸泡后再冲洗。 2、无菌器材和液体的准备将玻璃器具中的培养皿、培养瓶、试管、吸管等按上述方法洗净烘干后，用一洁净纸包好瓶口并把吸管尾端塞上棉花，装入干净的铝盒或铁盒中，于120℃的干燥箱中干燥灭菌2小时，取出备用。对于手术器械、瓶塞、工作服以及新配制的PBS洗液，则采用高压蒸气灭菌法，即在15磅的条件下，加热20分钟。而对于MEM培养液、小牛血清和消化液等需用G5或G6滤器负压抽滤后使用。 3、无菌操作过程在无菌操作过程中，**重要的是要保持工作区的无菌、清洁。因此，在操作前20～30分钟要先启动
超净台和紫外灯，并认真洗手和消毒。在操作时，严禁喧哗，严禁用手直接拿无菌物品，如瓶塞等，而必须用消毒的止血钳、镊子等。培养瓶应在
超净台内操作，并且在开启和加盖瓶塞时需反复用酒精灯烧。对于吸管应先用手拿后1/3处，戴上胶皮乳头，并用酒精灯烧烤之后再吸液体。 4、常用清洁液的配制法⑴重铬酸钾清洁液：可根据不同需要，选用下列的任何一种浓度。先将重铬酸钾溶于水中，再慢慢加入浓硫酸。注意，此#p#分页标题#e#
时可产生高热，应防止容器破裂。重铬酸钾清洁液除污力强，腐蚀性大，应避免接触皮肤和衣服。为防止吸收空气的水分而变质，此液应贮存于带盖的容器中。如清洁效力较差，可再加入少量重铬酸钾及浓硫酸，还可继续使用。直到液体变蓝绿色，即不能再用。配制重铬酸钾清洁液时，宜用耐高温的陶瓷缸或耐酸搪瓷或塑料容器。使用玻璃器皿时，应特别注意防止产生高热而破裂，切忌用量筒来配制。 ⑵磷酸三钠将其配成5%～10%水溶液，可用于洗涤玻璃器皿上的油污，但经常使用腐蚀玻璃，使器皿表面模糊、毛糙。 ⑶硝酸清洁液将其配成50%水溶液，可用于清洁微量滴定筒。⑷乙二胺四乙酸二钠（EDTA钠盐）将其配成5%～10%水溶液，可洗脱粘附于玻璃器皿内壁的白色沉淀物。⑸尿素溶液尿素是溶解蛋白质的良好溶剂，适用于洗涤粘附有血液血清等蛋白质的吸管、试管等。
无菌操作法
2007-10-24 17:23 【大 中 小】【我要纠错】 无菌操作法，是整个过程控制在无菌条件下进行的一种操作方法。某些药品加热灭菌后发生变质、变色或降低含量者可采用无菌操作法制备。此种无菌操作，不仅用于注射剂而且对其它的如滴眼剂、海棉剂等用于粘膜和创伤的制剂也均适用。无菌操作室或无菌操作所用的一切用具、材料以及环境，均须应用面所述灭菌法灭菌，操作须在无菌操作室或无操作柜内进行。
（一）无菌操作的空气灭菌可应用上节《气体灭菌法》中所述的甲醛、丙二醇、乳酸、三甘醇等。其具体用法不再赘述。药厂大型无菌操作，常用甲醛溶液加热熏蒸进行空气灭菌。将甲醛溶液放入瓶内，逐渐被吸收蒸气夹层加热锅中，甲醛溶液被加热，甲醛蒸气经气出口送入总进风道，由鼓风机吹入无菌操作室，连续3小时后，一般即可将鼓风机关闭。室温应保持25℃以上，以免室温过低甲醛蒸氯了聚合而附着于冷表面，湿度应保持60％以上，密闭熏蒸12－24小时以后，再将25％氨水加热（每m3用8－10ml），从总风道送入氨气约15分钟，以吸收甲醛蒸气，然后开启总出口排风，并通入经处理过的无菌空气直到室内无臭气为止。 除用上述方法定期进行较彻底的灭菌外，还要对室内的空间、用具（桌椅等）、地面、墙壁等，用3％酚溶液、2％煤酚皂溶液、0.2%新洁而或75％酒精喷洒或擦试。其它用具尽量用热压灭菌法或干热灭菌法灭菌。每天工作前开启外线一小时，中午休息时间也要开1／2－1小时。
（二）无菌操作操作人员进入操作之前要洗澡并换上已经灭菌的工作服和清洁的鞋子，不使头发、内衣等露出来，以免造成污染机会。安瓿要150－180℃2－3小时干热灭菌。橡皮塞要以121℃1小时热压灭菌。有关器具、机器都要经过灭菌。用无菌操作法制备的注射剂， 大多要加入抑制。医学教育网搜集整理 小量无菌制剂的制备，也可在无菌操作柜中进行。无菌操作柜分小型无菌操作与联合无菌无操作两种小型无菌操作柜又称单人无菌柜。式样有单面式与双面式两种。操作柜的架子用木制，四周配以玻璃，前面操作下装木板，挖二圆孔，孔内密接橡皮手套或袖套。药品及用具等，由侧门送入柜内后关闭。操作时可完全与外界空气隔jue。柜内空气的灭菌，可在柜中央上方装一小型紫外线灯，使用前1小时启灯灭菌，或用药液（如3％酚溶液）喷雾灭菌。联合无菌操作柜是由几个小型操作柜联合制成，以使原料的精制，传递分装及成品暂时存放等工作全部在柜内进行。近年来，采用层流
洁净工作台作无菌操作，使用方便，效果可靠。
意义
无菌是指在环境中一切有生命活动的微生物的营养细胞及其芽孢或孢子都不存在的状态。在微生物实验中， 操作的目的在于防止待接种细菌被杂菌污染。只有在培养基、实验器皿等处于无菌的前提下，才能保证菌种不被污染。 接种细菌时，应注意以下几项：
（1）在超净工作台上操作，工作台在使用前要紫外消毒，酒精消毒等 （2）应在酒精灯火焰前操作
（3) 取菌种前灼烧接种针或接种环（要烧红）
（4）烧红的接种针（环）稍事冷却再取菌种，以免烧死菌种 （5）接种后应尽快塞上棉塞
总之，一句话，尽可能防止杂菌污染！！！！
